mNGS：病原體感染檢測困境的“破局者”

發布日期：2024-09-14瀏覽次數：

肺部感染（Pulmonary Infection）是指由包括細菌、真菌、病毒等各種病原體引起的包括支氣管、肺泡和肺間質等肺實質性感染，其臨床癥狀多為發熱、咳嗽、咳痰、胸悶等，是世界范圍內死亡和發病的主要原因。特別是在免疫功能低下者及老年人群中發病最為常見，治療不及時會發展為重癥肺炎、呼吸衰竭等，預后很差，病死率高，其中重癥社區獲得性肺炎（severe community-acquired pneumonia，SCAP）的院內死亡率更是可以達到50%以上。早期病原學診斷是實施精準抗感染治療的基礎，并且對患者的預后具有顯著影響。因此，臨床上快速、準確的檢測和鑒定肺部感染的病原體進而對患者實行針對性治療及其關鍵。 臨床病原微生物檢測的困境與突破 由于常規微生物學檢測技術較慢，且檢測率較低，PCR技術在部分醫院未能開展，因此對于感染性疾病病原微生物診斷率較低，多數感染，尤其是重癥感染，多選用經驗性廣譜覆蓋治療，易導致不能覆蓋致病微生物、延誤病情或醫療資源浪費。 近年來，宏基因高通量測序技術（met-agenomics next-generation sequencing，mNGS）越來越多應用于感染性疾病病原微生物的檢測，其通過對病原微生物基因片段的高通量測序獲得標本中病原體的遺傳信息，敏感度高，耗時短，對常規檢測難以檢出的病原微生物更有優勢，作為一種具有較高臨床價值的新型分子診斷方法它能快速準確地檢測血液、呼吸道、中樞神經系統、膿腫、局部組織和其他標本中的病原體，可為明確病原微生物提供直接證據，從而盡快給予有效治療。mNGS在肺部感染、呼吸機相關肺炎、免疫受損宿主肺炎病原微生物診斷方面的優勢亦有研究報道。 mNGS在細菌中的應用 細菌在肺部感染病原體占據重要地位，目前臨床上最常用的檢測方法是對分泌物等標本進行細菌培養，但培養的結果一般僅為常見的細菌，而對于特殊菌、罕見菌的效果欠佳。而mNGS是直接檢測病原微生物的基因片段，并不依賴于對致病菌的培養驗證，亦不受抗生素影響，能夠檢測更多種類的病原微生物，包括難以培養的微生物，這對于復雜感染和罕見病原體的診斷具有重要價值。大量的研究表明，mNGS對病原菌的檢測陽性率高于傳統培養法，彌補傳統細菌培養的不足。 在一篇已公布的病例報告中（https://doi.org/10.3389/fmed.2022.755308）報道了 1 例考慮結核分枝桿菌感染的老年患者，經過血檢、培養、支氣管鏡等結核相關檢查均未檢出結核分枝桿菌，為明確患者致病病原體對支氣管肺泡灌洗液(Broncho Alveolar Lavage Fluid, BALF)行 mNGS 檢測，檢測結果不僅檢出了結核分枝桿菌，還包括白色假絲酵母菌。該研究結果提示了 mNGS 在結核分枝桿菌檢測中的潛力。 后續在另一個團隊中，研究者們開展了對 311 例疑似和確診肺結核患者的 BALF 標本進行了 mNGS 檢測，并與包括結核 X-pert 檢測、痰培養、抗酸桿菌染色等在內的常規病原微生物檢測進行比較（https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.12.063）。他們發現在部分常規檢測方法陰性的標本中，mNGS 可檢測出結核分枝桿菌，這與其他研究報告的mNGS對結核分枝桿菌的檢測高于結核 X-pert 的靈敏度相吻合。對于非結核分枝桿菌，已有相關研究報道了利用 mNGS 在肺部感染患者 BALF 中檢測出的報道，這也是對常規檢測方法的補充。 綜上，與傳統病原體檢測相比，mNGS 不但在常見細菌的檢測中占優勢，還對罕見菌的檢測有較大價值。 mNGS在真菌中的應用 近年來隨著因病情等需要使用免疫抑制劑的高危人群增多，肺部真菌病的患病率呈明顯上升趨勢。人體肺部感染的真菌多為機會致病菌，且傳統的檢測方式耗時較長。 肺孢子菌和曲霉菌是引起人類肺部感染的常見真菌，在免疫抑制人群中為甚。如肺孢子菌易發生在 HIV 患者中引起肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia, PCP)，但近年來關于非 HIV 型肺孢子菌肺炎確診的患者逐漸增多。相關研究（https://doi.org/10.3389/fmed.2022.819425）對 4 份非 HIV 感染的肺孢子菌肺炎病例使用 mNGS 與傳統檢測方法進行比較，結果顯示 mNGS 檢測出肺孢子菌的時間明顯短于傳統檢測方法。而對于曲霉菌，目前已有相關研究報道了與常規真菌檢測方法相比 mNGS 能提高曲霉菌檢出的陽性率。此外，有研究者利用mNGS 技術報道了非免疫功能抑制的患者也可能出現侵襲性肺曲霉菌。 綜上，mNGS 在真菌感染中的診斷價值遠大于傳統檢測方法。 mNGS在病毒中的應用 在臨床工作中由病毒引起的肺部感染也并不少見，如鼻病毒、腺病毒、冠狀病毒及呼吸道合胞病毒等。傳統的病毒檢測方法主要包括血清學試驗(抗原和抗體檢測)和核酸檢測等，但這些檢測方法均靶向特定病毒檢測，病毒覆蓋范圍較小，而 mNGS 檢測幾乎可檢測樣本中所有的病原體，因此在病原檢測中具有明顯優勢。一項研究報告（https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2019.10.007）的研究結果提示 mNGS 技術與病毒核酸 PCR 相比，mNGS 檢測具有高靈敏度和高特異性。此外，他們利用 mNGS 技術還檢測出了傳統檢測方法未檢測到的病毒如丙型流感病毒等，但未檢出病毒是否致病尚需要進一步研究。 因此，mNGS 在檢測肺部病毒方面有很高的實用價值，這也在近些年的新冠病毒感染中發揮了巨大作用。 mNGS在特殊病原體中的應用 支原體、衣原體作為非典型病原體，也是肺部感染中常見的致病菌，尤其是支原體常引起兒童和青年肺部感染。一項研究（https://doi.org/10.1186/s12879-020-05085-5）利用 mNGS 技術對支原體感染肺炎患者進行早期診斷，為支原體感染患者早診斷、早治療提供幫助。此外，有研究者發現 mNGS 可顯著提高兒童重癥支原體肺炎中混合感染的檢出率，尤其是合并病毒的混合感染。同時 mNGS 對于衣原體感染也有應用價值，已有研究報道傳統方法未檢出但利用 mNGS 技術檢測出鸚鵡熱衣原體的病例，這提示 mNGS 在診斷鸚鵡熱衣原體肺炎中的潛在優勢。 mNGS在肺部混合性感染中的應用 肺部混合性感染是由多種致病微生物引起，其臨床癥狀不典型，且肺部感染進展快、病情重、病死率高，為患者帶來巨大的風險。而mNGS的病原體檢測范圍廣泛，其無偏性測序對混合感染病原體的檢出更具優勢。 一項通過對 55 例混合性肺部感染患者進行分析的結果顯示，mNGS 診斷混合性肺部感染的靈敏度遠高于傳統檢測方式，這提示 mNGS 在診斷混合性肺部感染方面具有快速、準確的特點。此外，他們還發現 mNGS 能夠檢測出常規檢測方法未檢測出的病原體，另一個研究團隊也報道了 mNGS技術鑒定出的病原體遠多于傳統培養方法，這也提示 mNGS 在多種病原體混合性感染診斷中的絕對優勢。 mNGS的優勢和局限性 優勢： mNGS 在鑒別病原體過程無需預先設定目標病原體、不需要特異性引物、不受基因突變的影響，其檢測周期短、檢測范圍廣泛、靈敏度高，并且 mNGS 可鑒定病原體的分型及毒力基因檢測。在治療中與常規檢測方式相比 mNGS 的檢出率受抗生素的影響較小，不易因早期經驗性使用抗生素導致病原體檢測出現假陰性情況，且 mNGS 的結果可以指導抗生素的使用。此外，mNGS 對于耐藥基因的檢測在臨床上也有一定進展，mNGS 可通過對微生物的基因組進行測序，評估耐藥基因的多樣性及抗性，進而為發現新的耐藥靶點有指導意義，也對耐藥菌群的新型敏感抗生素的研發具有重要的潛在價值。 局限： 1)數據庫落后、不完整：mNGS 對病原微生物的鑒別能力主要取決于參考數據庫的完整性，目前數據庫中有大量已知微生物的序列信息，但仍需要精心設計并不斷進行更新完善。 2)標本易污染：在 mNGS 標本從采集處理到送檢過程中有許多步驟容易受到污染，如采樣不規范、試劑盒污染等，這都會導致異常的結果偏差，最終影響臨床醫生判斷。 3)結果解讀問題：mNGS 檢測出的病原微生物雖然較多，但目前還無法區分致病菌、定植菌和污染菌等，因此 mNGS 最終呈現的結果并不能直接采用，還需要臨床醫生結合患者癥狀、體征及輔助檢查結果等綜合進行判讀。 4)檢測價格昂貴：目前因為其檢測成本，mNGS 價格仍較高，尤其是檢測核酸遺傳信息等對患者經濟負擔較重，難以在臨床上普及。